Americká armáda potvrzuje, že PCR testy na ebolu provedené na stejných lidských vzorcích dávají protichůdné výsledky

Výsledky výzkumu z Fort Detrick zpochybňují spolehlivost testu pro detekci případů eboly.

Studie spojená s americkou armádou, publikovaná v roce 2023 ve Scientific Reports , ukazuje, že výsledky testů RT-PCR na ebolu se měnily v závislosti na tom, jak byly vyvinuty syntetické primery a sondy testu – stejné lidské vzorky byly v jedné konfiguraci PCR na ebolu negativní a v jiné pozitivní.

PCR testy se v současnosti používají k detekci případů eboly, které vlády následně používají jako ospravedlnění pro karantény a další autoritářská opatření v boji proti ohniskům nákazy.

Pokud však existuje důvod pochybovat o samotných testech, pak existuje i důvod pochybovat o reakci vlády na „případy“, které identifikovala.

Studie, kterou provedli výzkumníci z Lékařského výzkumného ústavu infekčních nemocí americké armády (USAMRIID) a částečně financovala Agentura pro snižování obranných hrozeb (DTRA), přímo vyvrací představu, že PCR testy na ebolu představují fixní, stabilní nebo samovalidující se diagnostický systém.

Studie byla financována:

• „Agentura pro snižování obranných hrozeb (DTRA) a Divize pro zdravotní dohled ozbrojených sil (AFHSD), Divize pro dohled nad globálními nově vznikajícími infekcemi (GEIS).“

Podle článku:

„Porovnání výkonnosti nového testu s předchozími testy s použitím řady vzorků lidského EBOV potvrdilo zvýšenou citlivost testu, což se odrazilo v nižších hodnotách Cq a vedlo k identifikaci tří vzorků jako pozitivních, které měly v původním testu negativní výsledek.“

Jinými slovy, stejné lidské vzorky vedly ke protichůdným výsledkům testů na ebolu v závislosti na použité konfiguraci syntetických primerů a sond.

Publikace opakovaně uznává, že drobné odchylky v sekvenci mezi primery/sondami testu a zamýšlenou cílovou sekvencí významně změnily výsledky testu na ebolu.

Podle studie:

„Varianty v sekvenci primeru nebo sondy a cílovém organismu mohou vést ke snížené citlivosti, chybám v testu a falešně negativním výsledkům.“

Vědci zjistili, že i odchylka jedné nebo dvou nukleotidů dramaticky změnila amplifikační chování.

Publikace uvádí:

„Jeden nebo dva nesoulady primerů nebo sond vedly k účinkům v rozmezí od minimálních až po snížení citlivosti o téměř dvě logaritmické úrovně.“

Studie dále uvádí:

„Jediný nesoulad mezi primerem a templátem měl pouze malý vliv (změna Cq <0,5) na citlivost testu, zatímco dva nesoulady vedly k významnému vlivu (změna Cq > 4,5).“

PCR amplifikace je exponenciální, což znamená, že posun o 4,5 cyklů je významný.

Studie konkrétně zjistila:

„Reverzní primer v reverzním testu Ebo-TM (G18A) vykazoval dva nesoulady v Kikwitu a Makoně, což vedlo k významnému snížení citlivosti o 4,9, respektive 4,55 Cq.“

Studie rovněž uznává, že předchozí systémy PCR pro ebolu byly od samého začátku založeny na neúplných genomických předpokladech.

Publikace uvádí:

„V té době byly testy vyvíjeny s využitím omezených dostupných genomických informací.“

Výzkumníci uznali, že pozdější sekvenování během epidemie odhalilo další sekvenční diverzitu u eboly, což by mohlo tyto dřívější testy zpochybnit.

Publikace uvádí:

„Rychlé sekvenování genomu provedené během epidemie identifikovalo genomovou diverzitu, která by mohla negativně ovlivnit dříve vyvinuté testy.“

Studie opakovaně varuje, že údajně „neobjevená“ sekvenční diverzita by mohla vést k tomu, že vzorky pozitivní na ebolu budou zcela přehlíženy.

Podle článku:

„Riziko falešně negativních výsledků testů se zvyšuje kvůli neobjevené genetické rozmanitosti.“

Výzkumníci poté změnili pravidla molekulárního rozpoznávání samotného testu přepracováním primerů a sond a zavedením „degenerovaných nukleotidů“ pro rozšíření shody sekvencí.

Podle studie:

„Test Ebo-TM jsme přepracovali tak, aby zohledňoval všechny v současnosti známé varianty EBOV v cílové oblasti testu, a to začleněním degenerovaných nukleotidů pro zmírnění dopadu neshod na výkon testu.“

Přepracovaný test byl následně validován pomocí počítačem podporovaných sekvenčních databází.

Podle publikace:

„Analýza in silico ukázala, že tento nový test vykazoval 100% shodu s 99,7 procenty všech sekvencí EBOV v GenBank.“

Publikace rovněž uznává, že přepracovaný test byl založen výhradně na „všech známých“ variantách viru Ebola.

Podle studie:

„Testy inkluzivity ukázaly, že nový test EBO-TM2 byl schopen detekovat všechny známé varianty EBOV.“

Fráze „všechny známé“ je významná, protože implicitně uznává, že další, dosud neobjevená sekvenční diverzita by mohla v budoucnu opět podkopat současné testy – stejně jako nově objevená sekvenční diverzita podkopala testy předchozí.

Studie také naznačuje, že smíšené populace sekvencí v samotných vzorcích by mohly změnit chování amplifikace.

Podle článku:

„Mohla by malá virová populace v kmeni EBOV-Mayinga obsahovat varianty zachycené primery G14A a G18A, což by vedlo k mírnému zlepšení účinnosti amplifikace?“

Důležité je, že ačkoli článek předpokládá, že přepracovaný test byl přesnější, studie nikdy nezávisle neprokázala, který výsledek testu byl u kontroverzních lidských vzorků skutečně správný.

To znamená, že publikace nikdy nezávisle neurčila, zda byl původní test chybný, zda byl chybný i přepracovaný test, nebo zda protichůdné pozitivní a negativní výsledky testu Ebola byly pouze artefakty měnících se předpokladů týkajících se PCR primerů a sond.

Publikace přímo dokázala:

• Jedna konfigurace testu přinesla negativní výsledky.
• Jiná konfigurace testu přinesla pozitivní výsledky.
• a tytéž lidské vzorky změnily svou diagnostickou klasifikaci v závislosti na tom, jak byl samotný PCR systém navržen.

Tato práce v konečném důsledku představuje testování eboly RT-PCR jako vysoce sekvenčně závislý molekulární detekční systém, jehož výsledky jsou významně ovlivněny:

• vyvíjející se předpoklady o sekvenci,
• neúplné genomové databáze,
• návrh primerů a sond,
• tolerance vůči neshodám
• a probíhající rozhodnutí týkající se přepracování testu.

Závěr

Práce ukazuje, že výsledky PCR pro ebolu se změnily, když byly změněny primery a sondy v testu, že stejné lidské vzorky vedly k protichůdným pozitivním a negativním klasifikacím eboly za různých konfigurací testu a že nově objevená sekvenční diverzita podkopala předchozí systémy PCR pro ebolu založené na neúplných genomických předpokladech.

Rozhodující je, že studie nebyla schopna v žádném okamžiku nezávisle prokázat, který výsledek testu byl u kontroverzních lidských vzorků skutečně správný.

Studie místo toho ukázala, že samotné diagnostické výsledky eboly se měnily v závislosti na tom, jak byl systém PCR vyvinut.

Studie dále uznává, že údajně „neobjevená“ sekvenční diverzita může v budoucnu i nadále podkopávat současné testy, stejně jako nově objevená sekvenční diverzita podkopávala testy předchozí.

To znamená, že systémy RT-PCR pro ebolu budou i nadále závislé na neúplných genomových databázích, vyvíjejících se předpokladech sekvencí, měnících se designech primerů/sond, rozhodnutích týkajících se tolerance nesouladů a neustálém přepracovávání samotného testu.

Pokud stejné lidské vzorky mohou vést k protichůdným výsledkům testů na ebolu v různých konfiguracích PCR – bez možnosti nezávisle určit, který výsledek byl skutečně správný – pak je spolehlivost testů používaných k zaznamenávání „případů“ eboly a k odůvodnění karantén a dalších opatření k boji proti epidemii na základě těchto čísel případů vážně zpochybněna.

Od Jona Fleetwooda