V roce 2008 laboratoř Baric zveřejnila návrh uměle vytvořených koronavirů bez jakýchkoli rozpoznatelných stop po jejich výrobě

Pomocí techniky „No See’m“ se Baricovi a jeho kolegům podařilo odstranit z hotového genomu koronaviru všechny viditelné stopy sestavování genomu v laboratoři.

V kapitole o metodách publikované v roce 2008 v laboratoři Ralpha Barice byl kompletní protokol pro digitální konstrukci genomů koronaviru otevřeně publikován v plném znění na počítači, načež byly tyto genomy fyzicky sestaveny do finální sekvence genomu, přičemž z této sekvence byly odstraněny všechny viditelné stopy genetické manipulace.

Kapitolu s názvem „ Systematické sestavování a genetická manipulace s genomem myšího viru hepatitidy A59 “ napsali Eric F. Donaldson, Amy C. Sims a Ralph S. Baric a publikovali ji v Methods in Molecular Biology , knižní sérii nakladatelství Springer/Humana Press, která obsahuje laboratorní protokoly.

Stáhnout 978 1 59745 181 9 Kapitola 21, 707 KB ∙ PDF soubor

Jádrem systému je technologie „No See’m“.

Baric tuto techniku ​​již popsal v publikaci z roku 2006 takto:

„Místa bez viditelnosti lze použít k vložení cizích genů do virových, eukaryotických nebo mikrobiálních genomů či vektorů a zároveň odstranit všechny stopy restrikčních míst použitých při manipulaci s rekombinantní DNA.“

V kapitole z roku 2008 autoři vysvětlují, jak to funguje v praxi s koronaviry:

„Vyvinuli jsme platformu pro sestavení DNA, která využívá nespecifické, vysoce variabilní sekvenční signatury restrikčních enzymů typu IIs k sestavení molekulárního klonu kmene A59 myšího koronaviru hepatitidy (MHV) v plné délce. Tento přístup také umožňuje vložení modifikací do fragmentu DNA navržením primerů obsahujících restrikční místo a požadované mutace. Přidáním restrikčního místa typu IIs ve správné orientaci následné štěpení odstraní restrikční místo a zanechá lepkavý konec obsahující požadovanou mutaci, připravený k ligaci s druhým fragmentem generovaným paralelně jako jeho komplement. V této kapitole se budeme zabývat detaily metody sestavení infekčního klonu MHV v plné délce a následným vložením specifické mutace do klonu, abychom demonstrovali sílu tohoto unikátního přístupu „ne“ specifického pro dané místo, který demonstruje mutagenezi See’m.“

Rozdělili genom koronaviru na sedm modulárních fragmentů cDNA.

Pomocí počítačem podporovaných primerů zavedli do každého fragmentu dočasná restrikční místa typu II.

Tyto části byly po digesci zcela odstraněny.

Výsledné lepkavé konce bez jizev byly ligovány dohromady za vzniku cDNA o plné délce obsahující pouze přesnou sekvenci naprogramovanou vědci v počítači – bez zbývajících restrikčních míst, linkerů nebo jiných laboratorních markerů.

Bez techniky „no see’m“ by konečně sestavený genom údajně vykazoval zjevné laboratorní stopy: další místa pro restrikční enzymy na každém spojení, linkerové sekvence, duplikované motivy a další stopy umělého klonování, které by okamžitě odhalily, že genom byl rozřezán a znovu sestaven v laboratoři.

Publikace uvádí, že platforma je již v provozu a široce využívána:

„Do klonu MHV bylo tímto přístupem vloženo více než sto mutantů, což daleko převyšuje počet všech ostatních dříve popsaných reverzních genetických systémů pro koronaviry. Tato technologie byla navíc použita k rychlému vývoji činidel v reakci na nově identifikované, vznikající koronaviry.“

Již v roce 2008 publikovala Baricova laboratoř přesný molekulární scaffold potřebný k vytvoření počítačem generovaných, bezestopých genomů koronaviru – finálních sekvencí, které by mohly být navrženy tak, aby vypadaly jako přirozeně cirkulující kmen.

Mohla by zcela bezestopá „neviditelná“ konstrukce genomového inženýrství, kterou v roce 2008 publikovala laboratoř Ralpha Barice – schopnost digitálně navrhovat a fyzicky sestavovat genomy koronaviru v plné délce a zároveň zcela odstranit jakýkoli laboratorní podpis z finální sekvence – vysvětlit, proč skutečný původ SARS-CoV-2 zůstává navzdory letům intenzivního mezinárodního výzkumu nejasný?

Od Jona Fleetwooda